Kligler Hierro Agar.

Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiología de alimentos para la diferenciación de enterobacterias, en base a la fermentación de glucosa y lactosa, y a la producción de ácido sulfhídrico.

Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona de carne y la tripteína, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe ³⁺, los cuales se combinan con el ácido sulfhídrico y  producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico. El agar es el agente solidificante.
Por fermentación de azúcares, se producen ácidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio ácido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrógeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el típico sulfuro de hierro de color negro.

Siembra
A partir de un cultivo puro del microorganismo en estudio, sembrar el medio de cultivo, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.

Incubación
A 35-37°C durante 24 horas, en aerobiosis.

Resultados

Pico alcalino/fondo ácido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa.

Pico ácido/fondo ácido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, y lactosa.

Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azúcares.

La presencia de coloración amarilla nos indica fermentación de carbohidratos, aunque sea sólo de glucosa (si el otro extremo es rojo) y esta función metabólica es típica de anaerobios facultativos.

La bacteria puede reducir el SO₄ (sulfato ferroso) a H₂S (ácido sulfhídrico), este se combinará con el Fe (hierro) para formar FeS (sulfuro de hierro) el cual proporciona un aspecto negro al extremo inferior. La producción de gas dentro del agar provocará grietas, burbujas o desplazamiento del mismo hacia arriba.

Interpretación de resultados

 

Se debe examinar la parte superior e inferior del medio y valorar la coloración

a)    En el extremo superior

Rojo.- No fermentan lactosa, sacarosa o ambas.
Amarillo.- Fermenta lactosa, sacarosa o ambas.

Explicación: El color amarillo indica un pH bajo debido a la producción de ácidos en grandes cantidades por la fermentación de la lactosa y/o sacarosa. Si la bacteria no fermenta lactosa y/o sacarosa la producción de ácidos es nula o, en caso de las enterobacterias, mínima (ya que todas fermentan la glucosa, generando ácidos en pequeñas cantidades) aunque no lo suficiente para contrarrestar la alcalinidad del medio, la cual se manifiesta con un intenso color rojo.

b)    Extremo inferior.

Rojo.- Sin fermentación, la bacteria es un aerobio obligado.
Amarillo.- Fermentación, la bacteria es un aerobio facultativo.

Negro.- Producción de H2S.

Grietas, burbujas o elevación del medio.- Producción de gas.

Explicación: La coloración sigue el mismo patrón, indicando el pH en base a la fermentación de carbohidratos. La presencia de un color rojo a este nivel, no sólo nos dice que la bacteria no fermenta lactosa y sacarosa, además es indicativo de que no fermenta glucosa y por tanto necesita oxígeno para oxidar éstos carbohidratos y obtener energía de ellos, siendo así un microorganismo aerobio obligado.
La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas.

El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce ácido sulfhídrico.